Метод Бильшовского — метод выявления нейрофибрилл в гистологических срезах, применяется в микроскопии для окраски нервной ткани; предложен немецким невропатологим Максом Бильшовским.

Методика окрашивания по Бильшовскому

  • Материал фиксируют 10–20% раствором формалина не менее 3 дней (оптимум — 3 до 9 недель, при быстрой фиксации образцы лучше фиксировать при температуре раствора 37° C).
  • Фиксированный материал 2–3 часа промывают в проточной воде и 24–48 часов — в дистиллированной воде.
  • Образцы режут на замораживающем микротоме (5–10 мкм) и переносят срезы в дистиллированную воду.
  • Срезы переносят стеклянной палочкой в 2% раствор химически чистого азотнокислого серебра и выдерживают 24 часа (чаще всего готовят 10% раствор азотнокислого серебра, который разводят дистиллированной водой).
  • Срезы проводят через раствор аммиачного серебра и редуцируют формалином.

Необходимая посуда — кристаллизаторы и мерные цилиндры, вымытые технической серной кислотой. Для всех процедур лучше использовать бидистиллированную воду.

Приготовление аммиачного серебра

Раствор аммиачного серебра приготовляют ex tempore — к 20 мл 2% раствора нитрата серебра добавляют 5 капель 40% гидроксида натрия; образуется бурый осадок, растворяемый прибавляемым по каплям аммиаком; гидроксид аммония, так же как и раствор гидроксида натрия должен быть свежим, их следует чаще менять.

Для лучшего растворения следует слегка потряхивать цилиндр, так как осадок растворяется в избытке аммиака, можно, добавив сразу 5 крупных капель аммиака, не взбалтывать жидкость, а лёгкими потряхиваниями поднимать в образующееся наверху светлое кольцо аммиака облачка осадка.

После полного растворения осадка приливают дистиллированную воду, доведя объём раствора до 40 мл.

Редукция

В 4 кристаллизатора наливают:

  1. Дистиллированную воду;
  2. Раствор аммиачного серебра;
  3. Дистиллированную воду;
  4. 20% раствор формалина.

Срезы переносят по отдельности переносят на несколько секунд в дистиллированную воду, а затем примерно на 5 минут в аммиачное серебро, где они расправляются и приобретают ещё более бурый цвет, затем снова на несколько секунд в дистиллированную воду, а затем в формалин. В формалине срезы темнеют, восстановление идёт очень быстро.

Вместо формалина для редукции можно использовать 20% раствор глюкозы или смесь: 75 мл 30% раствора глюкозы, 75 мл 10% раствора сегнетовой соли, 20 мл 10% раствора карбоната калия (поташа) и 5 мл чистого формальдегида.

Золочение и фиксирование

Золочение и фиксирование срезов не обязательно, но желательно.

  • Промывка в дистиллированной воде;
  • Погружение в раствор хлорида золота (к 10 мл дистиллированной воды добавить 3–5 капель 1% жёлтого раствора хлорида золота), срез держат в растворе до появления стального цвета;
  • Погружение срезов на 20–60 секунд в 5% раствор тиосульфата натрия;
  • Промывка в дистиллированной воде.

Проведение через спирты восходящей крепости, карболксилол; ксилол и заключение в канадский бальзам.